SBB：無機肥對土壤中固氮菌豐度和群落結構的影響25年的無機施肥處理對華南酸性土壤中固氮菌豐度和群落結構的影響Impact of 25 years of inorganic fertilization on diazotrophic abundance and community structure in an acidic soil in southern ChinaImpact Factor：5.290http://dx.doi.org/10.1016/j.soilbio.2017.06.019發表日期：2017-06-22第一作者：Chao Wanga通訊作者：Renfang Shen(沈仁芳)(rfshen@issas.ac.cn)a錛c合作作者：Manman Zheng錛 Wenfeng Song錛 Shilin Wen錛 Boren Wang錛 Chunquan Zhu主要單位：a中國科學院土壤研究所土壤與可持續農業國家重點實驗室(State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture錛 Institute of Soil Science錛 Chinese Academy of Sciences錛 Nanjing 210008錛 China)c中國科學院大學( University of Chinese Academy of Sciences錛 Beijing 100049錛 China)寫在前面分享標題：SBB：無機肥對土壤中固氮菌豐度和群落結構的影響關鍵字：作物栽培，固氮生物，長期無機肥料，養分有效性，nifH，生石灰應用點評：固氮微生物負責的生物固氮是一個重要的生物地球化學氮素循環過程。由于該生物過程可以為生態系統提供額外的氮源，從而改善土壤肥力，這有利于提高植物的生產力，因此它是農業系統中無機氮肥的潛在可持續替代品。然而，盡管已經進行了一些短期的小區試驗（在一個完整的生長季節內），但是，短期試驗不能提供一些只有在長期施肥條件下才能檢測到的有價值信息，因為土壤質量變化緩慢，微生物群落結構需要一定的時間才能穩定。因此對于農業生態系統中固氮菌對長期施肥的響應還沒有很好的了解。這裡，作者研究了經歷25年的無機施肥的酸性農田土壤中生長著玉米的土體土和根際土壤中的固氮微生物群落。詳細了解固氮菌的群落組成和豐度，以及它們與土壤環境的關系，將有助于我們更好地理解施肥的長期生態效應和固氮菌在農業生態系統中的生物功能，並減少無機氮肥的使用。摘要盡管固氮微生物在氮素循環中起著重要的作用，並為植物可利用氮的積累做出貢獻，但長期無機施肥對其種群的影響我們尚不清楚。這裡，我們研究了經歷25年的無機施肥的酸性農田土壤中生長著玉米的土體土和根際土壤中的固氮微生物群落。施肥管理包括不施肥對照，僅施氮肥，氮肥與生石灰共施，磷(P)和鉀(K)肥共施，N+P+K肥共施，N+P+K肥與生石灰共施。定量PCR和高通量焦磷酸測序的nifH基因用于分析固氮微生物的豐度和群落組成。所有施肥處理均提高了土壤養分有效性，但未施用生石灰的處理引起土壤酸化。N肥與N+P+K肥處理的玉米生物量和nifH基因拷貝數顯著降低但在P+K處理 中增加。生石灰的應用有效地減輕了N輸入的固氮抑制作用。施肥導致土壤微生物豐富度降低及固氮微生物群落組成發生變化。土壤pH和養分有效性對固氮豐度有協同作用，盡管土壤養分有效性似乎是塑造固氮群落結構的主要因素。在目前的研究規模上，根際效應增加了nifH基因的拷貝數，但並未明顯改變固氮群落的組成。總之，長期無機施肥對固氮菌群豐度和群落組成均有影響，且施肥處理對群落組成的影響大于生石灰修復或作物栽培。背景為了滿足日益增長的世界人口對糧食的需求，由此產生了集約化農業措施，其包括施用過量的無機肥料。在中國，以氮(N)，磷(P)和鉀(K)為基礎的肥料消費量從1961年的73萬噸增加到2013年的3894萬噸，預計在未來幾十年內將繼續增加。在過去的幾十年，農業生態系統中無機肥料(尤其是氮基肥料)的長期投入提高了土壤肥力和作物產量，但也產生了各種負面影響，例如土壤酸化，金屬毒性，較低的養分利用率，溫室氣體排放的增加和地下水污染，這些威脅到了土壤質量，作物生長，生物多樣性和環境健康，並改變了土壤營養元素(例如碳(C)，氮和磷)的生物地球化學循環。因此，如何安全地提高農業的可持續性受到越來越多的關注。N循環是影響陸地生態系統生產力和可持續性的重要營養循環。微生物是土壤氮素循環的重要參與者，在調控土壤氮素有效性和轉化方面起著重要作用，且與植物生產力密切相關。大量施肥對土壤氮循環產生了前所未有的影響，其涉及到多種多樣的微生物群落和功能的變化。迄今為止，大多數研究都集中在長期施肥對氨氧化和反硝化微生物的影響上，因為它們與土壤酸化、植物氮有效性和氮損失直接相關。固氮細菌(固氮微生物)負責生物固氮，這是另一個重要的生物地球化學氮循環。由于該生物過程可以為生態系統提供額外的氮源，從而改善土壤肥力，這有利于植物的生產力，因此它是農業系統中無機氮肥的潛在可持續替代品。然而，盡管已經進行了一些短期的微區試驗（在一個完整的生長季節內），但對于農業生態系統中固氮菌對長期施肥的反應方式還沒有很好的了解。因為，短期試驗不能提供一些只有在長期施肥條件下才能檢測到的有價值的信息，因為土壤質量變化緩慢，微生物群落結構需要一定的時間才能穩定。詳細了解固氮菌的群落組成和豐度，

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以及它們與土壤環境的關系，將有助于我們更好地理解施肥的長期生態效應和固氮菌在農業生態系統中的生物功能，並減少無機氮肥的使用，詳細了解固氮菌的群落組成和豐度，以及它們與土壤環境的關系，將有助于我們更好地理解施肥的長期生態效應和固氮菌在農業生態系統中的生態功能，從而減少無機氮肥的使用。施肥方式通過改變土壤特性直接或通過改變植物反饋間接影響土壤微生物群落結構和豐度。在長期施肥過程中，土壤理化性質的變化，如pH值、養分有效性、碳的數量和質量等，對土壤微生物種群產生了積極或消極的影響。固氮菌對土壤性質也很敏感。此外，植物作為另一個重要的驅動因子，與根際微生物群落的功能和活性有著密切的關系。玉米、水稻、大豆、高粱等作物的生長形成了根際獨特的固氮群落，其不同于土體土壤中的群落。並且根際微生物通過積極的或消極的性狀直接影響植物的生長。因此，根際中植物微生物相互作用的變化在農業生產中具有重要意義。以往關于長期施肥對土壤微生物群落影響的研究主要局限于土體土壤尺度。這導致我們缺乏對與植物相關的根際微生物群落對施肥反應的深入了解。無機氮輸入引起的土壤酸化已成為我國南方紅壤地區作物產量的主要限制因素。在農業管理中，石灰是治理酸性土壤、保持作物產量和改變微生物種群的有效手段。Xun等人報道，石灰的添加可以迅速增加酸性農田土壤的pH值和細菌多樣性。同樣，我們之前的研究發現，石灰施用于酸性土壤顯著提高了整體細菌和氨氧化菌的豐度，但是，此類信息不適用于固氮細菌。在這項研究中，樣本是從1990年建立的中國南方一個長期受肥區採集的。2010年採用了一些嚴重的酸化方法，並通過添加生石灰對部分地區進行了補救。該地區以往的研究主要集中在長期施肥對作物生產、土壤酸化、土壤酸化修復方法、土壤□活性、總體細菌豐度和氨氧化細菌豐度的影響上。然而，對固氮細菌的影響仍然是未知的。因此，我們選擇施肥25年的試驗點，研究不同施肥處理下土壤固氮種群的變化。目標是:(1)確定固氮菌豐度和群落組成對長期無機施肥的響應及其與土壤性質的關系；(2)評價長期無機施肥對根際效應的影響；(3)檢驗石灰修復是否也能改善酸性土壤中的固氮菌群。為此，我們選擇了固氮□還原□亞基基因nifH，因為它是分析固氮細菌豐度和多樣性最常用的標記基因。定量pcr和高通量測序分別用于測定nifH基因的豐度和群落結構。結果玉米生物量與土壤性質Maize biomass and soil propertiess與未施肥的對照相比，長期施氮顯著降低了玉米生物量(p0.05)，而PK處理則使生物量增加(圖. 1)。NPK和CK產生了同等的玉米生物量。生石灰(NCa和NPKCa)的施用顯著增加了玉米生物量，NPKCa處理的玉米生物量大于NCa處理(p0.05)。圖 1 25年(1990 – 2015)的長期施肥試驗的玉米生物量Maize biomass from the 25-year (1990e2015) long-term fertilizer experiment數據為平均數±標準差(n=15)。條柱上的不同字母表示肥料處理之間的差異顯著，p 0.05。土壤性質見表1。雙因素方差分析顯示，除pH、TC和TN外，施肥處理對土壤各性狀參數均有顯著影響(p0.01)，根系效應(土體與根際土壤)對各性狀參數也有顯著影響(*p*0.01或*p*0.05)。與塊狀土壤相比，根際土壤中SOC，DOC和DON的含量較高，而NH4+-N，NO3–N，AK和AP的含量較低。在土體土中，

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CK(5.38)、NCa(5.20)和NPKCa(5.12)的pH值差異不顯著，均高于N(4.04)、PK(4.95)和NPK (4.00) (p0.05)，其中N和NPK處理的pH值最低(**表 1**)。PK、NPK、NPKCa處理下TC、SOC、DOC含量均高于CK、N、NCa處理。含氮肥（N，NCa，NPK和NPKCa）處理下的NH4+-N，NO3–N和TN含量均高于不含氮肥（CK和PK）的處理，但NPKCa處理下的NH4+-N和NO3–N除外。同樣，在同時施用P肥和K肥的處理下，AK和AP的含量均增加。N處理的C/N比例最低，但與NCa處理無顯著差異。在CK、N、PK和NPK處理下，DON沒有顯示出統計學差異。表 1 25年(1990 – 2015)長期施肥試驗玉米栽培的土體和根際土壤理化性質Soil physicochemical properties in the bulk and rhizosphere soils of maize cultured for the 25-year (1990e2015) long-term fertilizer experiment數據為均值±標準差(n=3)。每行不同字母表示對于根際和土體土壤不同的施肥處理之間的差異顯著(p0.05)。每個處理中粗體星號表示土體和根際土壤存在顯著差異(*p*0.05)。TC：總碳； TN：總氮； C/N比：總碳/總氮； SOC：土壤有機碳； DOC：可溶性有機碳； NH4+-N：銨態氮； NO3–N：硝態氮； DON：可溶性有機氮； AK：有效鉀； AP：有效磷。nifH基因拷貝數及其與土壤性狀的關系nifH gene copy number and its correlation with soil properties雙因素方差分析顯示，施肥處理和根系效應對nifH基因拷貝數均有顯著影響(p0.01)(**圖. 2**)。此外，學生t檢驗表明，各處理根際土壤的nifH基因拷貝數均明顯高于土體土壤(*p* 0.01或*p* 0.05)。在土體土壤中，每克幹燥土壤中六種處理的平均拷貝數範圍為0.58*105至3.85105個基因拷貝(圖. 2)。與對照相比，PK組的nifH基因拷貝數較高，而N和NPK的nifH基因拷貝數顯著降低(p0.05)。在NCa和NPKCa處理中施用生石灰顯著減輕了N基肥料的這種抑制作用，甚至NPKCa中的nifH基因拷貝數也顯著高于CK(p0.05)。在根際樣品中也得到了相似的結果，但CK和NCa處理之間沒有顯著差異(圖. 2)。皮爾遜相關分析表明，在土體土壤中，nifH基因拷貝數與土壤pH，C/N和AP正相關，與NH4+-N和NO3–N負相關。根際土壤中nifH基因拷貝數與pH，C/N和AK呈正相關，與NH4+-N和NO3–N呈負相(表 2)。在所有土壤樣品中，包括土體土壤和根際土壤，nifH*基因拷貝數與pH，C/N，SOC，DOC和DON呈正相關，與NH4+-N和NO3–N呈負相關。圖 2 通過real-time PCR定量分析了25年(1990 – 2015)長期施肥試驗玉米栽培的土體和根際土壤中nifH基因拷貝數nifH gene copy number as quantified by real-time PCR in the bulk and rhizosphere soils of maize cultured during the 25-year (1990e2015) long-term fertilizer experiment所有數據均採用雙因素方差分析，T:施肥處理;R:根系效應(土體和根際)。白柱上方不同的小寫字母表明，在p0.05的水平上，土體土的施肥處理間存在顯著差異；灰柱上方不同的大寫字母表明，在p0.05的水平上，根際土的施肥處理間存在顯著差異。各施肥處理的星號(*p0.01和p0.05)表明土體土壤和根際土壤之間存在顯著差異。表 2 nifH基因拷貝數與各土壤變量間的Pearson相關系數Pearson’s correlation coefficients between total nifH gene copy number and various soil variables群落結構分析Community structure analyses經過氨基酸序列的質量過濾篩選，得到107錛039個高質量序列，每個樣本有870至5258個序列，OTUs的數量(90%相似度)根據樣本的不同，在42至109之間。為了比較群落組成的相似性和差異性，我們基于OTU組成進行了NMDS、層次聚類分析和ANOSIM分析。NMDS的stress值為0.09(圖. 3a)。本分析分為三組:CK和PK的土體和根際樣品;N和NCa的土體和根際樣品;以及NPK和NPKCa的所有樣品。層次聚類分析得到了類似的結果(圖3b)，群落形成了三個聚類，所有的NPK和NPKCa樣品，只含氮肥的處理(N和NCa)，以及CK和PK樣品。用ANOSIM分析了群落組成的差異，其中無氮處理(CK和PK)和含氮處理(N、NCa、NPK和NPKCa)之間存在顯著差異(p0.01)，而土體和根際樣品之間沒有差異。因此，施肥處理對群落組成和結構的影響遠遠大于根系效應和生石灰施用對群落的影響。由于不同施肥處理對根際土壤的影響較小，因此本研究的重點是土體土壤樣品。圖 3 25年(1990 – 2015)長期施肥試驗中玉米根際和土體土壤中固氮群落組成的非度量多維尺度分析(A)和層次聚類分析(B)Non-metric multi-dimensional scaling analysis (A) and hierarchical cluster analysis (B) of diazotrophic community composition in sampled maize rhizosphere and bulk soils from the 25-year (1990e2015) long-term fertilizer experimentB為土體土壤，R為根際土壤。樣品經三次重復分析。土體土壤固氮類群的OTU豐富度和相對豐度OTU richness and relative abundance of diazotrophic taxa in bulk soil在土體土壤中，所有的施肥處理都顯著減少了OTU的數量 (p 0.05) (圖. 4)。N、NCa、NPK和NPKCa處理之間無顯著差異(圖 4)，說明施用生石灰並不能緩解N肥的抑制作用。進一步的相關分析表明，OTU的數量與TN和NO3–N呈顯著負相關(p 0.05)。圖 4 25年（1990-2015年）長期施肥實驗中所有分析的土體土樣品中可操作分類單位的數量Numbers of operational taxonomic units across all of the analyzed bulk samples from the 25-year (1990e2015) long-term fertilizer experiment數據為均值±標準差(n=3)。不同字母表示不同施肥處理之間的差異顯著(p0.05)。利用NCBI中的BLAST算法，將所有處理中的OTUs分類為不同的屬。圖5顯示了六種肥料處理的土體土壤中9個相對豐度超過1%的最豐富的屬。其中以Bradyrhizobium最為豐富，佔全部土體土壤樣品nifH總基因序列的47.7% ~ 69.9%。不同施肥處理改變了這些主要屬的相對豐度 (圖. 5)。與對照相比，N和NPK均顯著增加了Methylosinus屬的相對豐度(p0.05)，同時降低了Bradyrhizobium，Rhodopseudomonas，Xanthobacter，及Caenispirillum屬的相對豐度。生石灰(NCa和NPKCa)的添加緩解了Bradyrhizobium屬相對豐度的下降，但對其他四屬無顯著影響。PK處理顯著降低了Bradyrhizobium和Azovibrio 屬的相對豐度(p0.05)，但提高了Rhodopseudomonas，Caenispirillum，和Phaeospirillum屬的相對豐度。此外，Phaeospirillum和Azospirillum在NPK處理中最豐富，生石灰(NPKCa)的加入降低了它們的相對豐度。圖 5 在所有分析的25年(1990-2015)長期肥料試驗的土體土壤樣品中9個最豐富屬(1%)的相對豐度(%)Relative abundances (%) of the nine most abundant genera (1%) across all of the analyzed bulk soil samples from the 25-year (1990-2015) long-term fertilizer experiment數據為均值±標準差(n=3)。每個屬的柱上的不同字母表示不同施肥處理之間的差異顯著(p0.05)。固氮群落結構與土壤變量的相關性Correlation between diazotrophic community structure andsoil variablesMantel檢驗表明，土體土壤中的固氮群落結構與多種土壤變量密切相關(p0.01 or *p*0.05)，相關系數變化趨勢為:C/N NH4+-N AK NO3–N AP TC SOC DOC pH。基于選擇的土壤變量和OTU組成，使用冗餘分析進一步分析了土壤性質對固氮群落結構的影響 (圖. 6)。這些土壤變量解釋了82.8%的變異，前兩個軸解釋了總變異量的64.0%和9.9%。根據向量，CK和PK處理的固氮群落均與較高的pH值相關，並且PK處理也與C/N和AK呈正相關。另外，較高濃度的TC，SOC和DOC對NPK處理的固氮種群有積極影響，而NO3–N和NH4+-N對N和NCa處理的固氮種群有積極的影響。這些土壤變量也與大多數豐富的屬相關。討論長期無機施肥影響土壤固氮豐度和OTU豐度Long-term inorganic fertilization influenced soil diazotrophic abundance and OTU richness長期施用無機肥料會降低土壤微生物的豐度。相似地，氮肥(如N和NPK處理)的投入降低了土壤固氮豐度(圖. 2)，可能是由于土壤酸化或高氮含量的負反饋作用。在一些長期試驗中，微生物豐度對低土壤pH值的負響應已經得到了很好的證明，這使得土壤pH值被認為是影響土壤微生物豐度的決定性因素。因此，本試驗的結果與預期一致(表 2)，其中25年的無機氮肥投入導致土壤酸化加劇(表 1)。此外，添加生石灰後固氮豐度的顯著增加進一步支持了這一解釋(圖 2)。氮源是生物體生長和代謝所必需的，但氮的富集通常會導致土壤固氮豐度的降低。在長期氮投入下，高的土壤NO3–N和NH4+-N含量顯著抑制固氮群落成員，表明與固氮豐度呈顯著負相關(表 2)。相比之下，在沒有N (CK和PK)的處理中，長期N缺乏會導致更大的C/N比(表 1)，導致自由生活的固氮菌具有競爭優勢。此外，PK處理下固氮豐度高于CK處理下的固氮豐度，這可能歸因于P的積極作用，P具有潛在的生物固氮作用。這解釋了固氮豐度與C/N和AP含量之間呈正相關的原因(表 2)。因此，固氮豐度的急劇變化可能是肥料作為養分的直接作用和土壤pH值變化的間接影響(這是長期無機肥施用的結果)的綜合結果。在某些農業土壤中，氮肥的增加導致細菌OTU豐富度和固氮多樣性的降低。土壤pH通常被認為是一個主要的影響因素。然而，我們觀察到在所有處理中固氮OTU含量均下降(圖 4)，OTU豐富度與TN和NO3–N之間呈顯著負相關，這表明在長期進行無機施肥時，土壤養分與pH對降低固氮OTU的豐富度的作用同等重要。同樣，Zeng等人(2016)報道，在高氮輸入下，土壤養分直接導致了農田表層土壤細菌OTU豐度的降低。對土壤pH值的關注可能是由于氮素輸入與土壤pH值的高相關性掩蓋了氮素效應。在本試驗中，當添加生石灰錛土壤pH值增加後，固氮OTU的豐富度並沒有增加(圖 4)，這證實了土壤pH可能不是降低固氮OTU豐富度的主要因素。因此，即使土壤pH值短暫恢復到對照水平，長期無機施肥所消除的固氮細菌的某些種類也難以恢復。長期無機施肥改變了固氮菌的群落結構Long-term inorganic fertilization changed the diazotrophic community structure長期施用無機肥料，特別是氮肥，改變了土壤微生物群落結構，包括總體和氧化氨細菌、真菌和氧化氨古細菌的水平。不出所料，在長期無機施肥的作用下，固氮群落組成發生了變化(圖 3)。首先，含N處理與不含N處理(PK和CK)的固氮群落組成之間存在顯著差異，表明與P和K相比，

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N對土壤固氮群落結構的影響更大。同樣，Coelho等人發現氮肥是固氮群落結構的決定因素。微生物群落結構的形成是一個復雜的過程，需要多個土壤變量的協同。氮輸入帶來的高的氮的有效性直接影響微生物群落結構。同樣，在其他研究中也觀察到，與氮有關的土壤特性(包括NO3–N，NH4+-N和C/N)是影響固氮群落結構的最主要因素(圖 6)。此外，土壤AP和AK是另外兩個重要因素，增加了固氮群體在PK和NPK處理下的數量(圖 6)。因此，土壤養分有效性(取決于肥料提供的元素)對固氮群落結構的形成至關重要。除了土壤養分有效性外，長期無機施肥還增加了土壤有機C含量(表1)，這證實了該試驗區以前的研究結果以及其他長期試驗的結果。在本試驗中，土壤有效碳庫也影響固氮群落結構(圖 6)。Cusack等報道了土壤有機質數量和質量的變化與不同施肥方式下土壤微生物群落的變化有關。事實上，農業管理中的平衡施肥可以維持和增加土壤的C有效性(TC、SOC和DOC)(表1)，這導致了NPK和N肥處理下固氮群落的差異(圖 6)。例如，幾種主要的固氮屬(Phaeospirillum和Azospirillum)表現出積極的TC、SOC和DOC響應。因此，農田生態系統通過平衡施肥提高了農業產量，從而形成了由C源誘導的相關微生物群落。在許多生態系統中，土壤pH值已經被很好地研究過，並且常常被認為是細菌群落結構的一個重要決定因素。然而，在目前的研究中並沒有觀察到這種決定性的作用，在這種情況下，土壤pH值與上述討論的土壤養分有效性相比不那麼重要。在其他長期施肥試驗中也觀察到類似的結果。此外，大多數豐富屬與土壤有效養分密切相關，而與土壤pH值無關。因此，固氮群落結構對長期無機施肥的響應機制可能不同于銨化菌和硝化菌，後者更容易受到土壤pH值變化的影響。這可能歸因于土壤類型和養分以及微生物種群的差異。最近，Xun等人報道了施用生石灰後，NPK處理下整體細菌群落組成的顯著變化，而另一項研究發現，

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在長期施肥試驗中，

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短期添加生石灰不會顯著改變細菌群落。同樣，在目前的研究規模下，我們沒有觀察到固氮群落在添加生石灰和不添加生石灰的情況下的分離差異(圖 3)。這一結果進一步證實了長期無機施肥所產生的土壤養分對土壤固氮群落結構的影響大于土壤pH值。優勢固氮屬對長期無機施肥的響應Responses of dominant diazotrophic genera to long-term inorganic fertilization雖然固氮菌的分類已被廣泛研究，但目前對于長期施肥條件的影響知之甚少。具體固氮屬對長期無機施肥的反應差異很大，主要取決于施肥類型(圖 5)。由于不同固氮屬對不同養分和土壤pH值的適應能力不同，施肥會改變其競爭力。在本試驗中，雖然Bradyrhizobium(通常被稱為共生固氮細菌)在所有處理下的相對豐度都顯著降低，但它們可能在酸性土壤的固氮中發揮重要作用，因為它們的數量最多(圖. 5)。同樣，Rhodopseudomonas， Xanthobacter， Caenispirillum， 及Methylosinus屬的相對豐度對氮肥輸入有明顯反應，而不是生石灰的施用，表明它們對氮非常敏感。這些結果與之前的研究一致，即低含量的無機氮源抑制了Bradyrhizobium、Rhodopseudomonas和Methylosinus的生長。然而，PK處理選擇性地刺激了一些固氮菌屬，包括Rhodopseudomonas， Caenispirillum，及Phaeospirillum (圖 5)，這在其他實驗中也被發現了。每個屬對肥料類型的不同響應可能直接導致固氮群落結構的變化。長期無機施肥對根際效應的影響Impact of long-term inorganic fertilization on the rhizosphere effect根際是一個復雜的環境點，植物生長通常通過影響與土壤變量的相互作用來影響土壤微生物群落。植物根系釋放的多種有機分泌物可以刺激微生物種群的生長，從而在根際形成相應的微生物群落組成。根際固氮種群豐度的增加在各種環境條件下已被廣泛報道。正如所料，我們觀察到在所有處理中，根際總固氮豐度都大于土體土壤(圖 2)，說明根際土壤生物固氮水平較高。本試驗根際土壤有效碳含量較土體土壤高，有效氮含量較土體土壤低，對固氮豐度有顯著的正向影響(表 2)。同樣，前人的研究表明，根系分泌物的釋放和土壤養分的吸收是由植物生長引起的，刺激了生物固氮。不同施肥處理之間植物生長的顯著差異可能影響植物與土壤微生物種群之間的關系。本試驗中根系對土壤固氮群落的影響與前人研究結果不一致。一些論文報告說，植物可以驅動給定地點或土壤類型內固氮群落的明顯變化。我們在另一個短期培養實驗中也得到了類似的結果(數據未發表)。而Ai等人認為，長期施肥增加了土壤養分有效性，降低了根際微生物對植物的依賴。在本試驗中，與施肥處理相比，根系效應對固氮群落幾乎沒有影響(圖3)。同樣地，Poly等人和Reardon等人也發現氮肥對固氮群落結構的影響大于作物對其的影響。Cotta等人也發現土壤類型及其相關特征對土壤固氮群落的影響遠大于根系效應。長期施肥可形成高度專門化的土壤特性和物理上不受幹擾的土壤環境，這在一個生長季節內不受植物的顯著影響。本試驗的土壤性質分析支持了這一觀點，其中肥料處理的影響大于植物因素(表 1)。植物與微生物相互作用的具體機制是復雜的，需要進一步研究，特別是長期暴露于不同的肥料處理下。結論本研究表明，25年的無機施肥對土壤固氮種群產生了很強的選擇力。N對固氮菌的影響可能大于P和K。在氮肥處理下較低的固氮豐度，可能會降低生物固氮能力。生石灰的施用可以通過增加土壤固氮豐度來改善酸性土壤的生物固氮，盡管它們對固氮群落組成和OTU豐度的影響不顯著。固氮豐度、群落組成和OTU豐度對土壤特征的不同響應模式揭示了固氮群體對長期無機施肥適應的復雜機制。平衡施肥和控制土壤酸度可能在提高生物固氮方面發揮重要作用。對于整體群落組成而言，施肥處理比根際效應影響更大，盡管根際固氮豐度顯著增加。未來的研究將確定哪些根系分泌物能更有效地調節固氮豐度的增加，如果施用能刺激土壤生物固氮，則可減少所需的無機氮肥投入。材料與方法實驗場地及取樣Experimental site and sampling施肥試驗始于1990年，地點位于中國湖南省祁陽紅壤實驗站(26°450’N錛 111°53’E)。場地土壤來源于第四紀紅粘土，屬鐵鋁始成土。每種肥料處理的面積大小為20m*10m，並設計有兩個重復樣地。夏玉米(Zea mays L. Yedan 13)和冬小麥(Triticum aestivum L. Xiangmai 4)按年輪作。耕作方式為常規耕作。無機肥料使用尿素(300kg N ha-1 year-1)，過磷酸鈣(53 kg Pha-1 year-1) 和氯化鉀(100 kg K ha-1 year-1)。先前已經描述了原始的土壤特性，施肥方法，自然環境和田間管理。播種前，在10 cm的深度上捆扎肥料。每年的化肥投入中，小麥佔30%，玉米佔70%。由于使用N和N+P+K(NPK)肥料的地塊表現出嚴重的土壤酸化作用，因此在2010年，這兩個地塊分別分為兩個部分。一部分保持與以前相同的施肥，而另一部分還根據相同的施肥規程施用了2550 kg ha -1的生石灰，隨後在2014年又添加了1500 kg ha -1的生石灰。在這個試驗中，選擇了六種不同的肥料處理:不施肥對照(CK)、僅施無機氮肥(N)錛無機N肥加生石灰(NCa)錛無機磷+鉀肥(PK)錛無機NPK化肥、無機NPK肥加生石灰(NPKCa)。土壤採樣時間為2015年6月12日(玉米開花期)。每種肥料處理均在3個3m*3m的子小區中隨機建立。由于每個處理中都有兩個重復的小區，所以從一個重復小區中隨機選擇兩個副小區，從另一個小區中隨機選擇另一個副小區。收集每個副小區5個玉米植株的根際土壤(深度0-15cm)，將這5個樣本混合成一個土壤樣本。用鐵鍬把每棵植物的根輕輕從農田裡移走，把附著在根上的土壤匯集起來，作為根際土壤。土體土壤取自不受根系幹擾的區域，不含從根系脫落的土壤。每一土體土壤樣本收集自每個副小區的5個土壤岩心(深度0-15cm，直徑2cm)。收集到的每個樣品都經過2毫米的篩孔，均質徹底，並分成兩部分。一部分用于土壤性質分析，另一部分用于DNA提取，應立即保存在-80°C。每棵植株的嫩枝和根同時收獲，用蒸餾水洗三次，徹底去除吸附的土壤顆粒。然後，將它們分別放入信封中，在70°C的溫度下烘幹，以獲得植物的幹重。土壤性質分析Soil property analysis對風幹土壤進行了pH、總碳(TC)、總氮(TN)、土壤有機碳(SOC)、有效磷(AP)和有效鉀(AK)的測定。新鮮土壤樣品被用來測定土壤銨(NH4+-N)，硝(NO3–N)，可溶性有機 碳(DOC)和有機氮(DON)。用pH計(Mettler Toledo FE20錛 Shanghai錛 China)測定去離子水(土壤:水，1:2.5)中的土壤pH值。使用硫酸重鉻酸鉀氧化法測量SOC。用Vario MAX CNS元素分析儀 (Elementar錛 Hanau錛 Germany)測定TC和TN。用0.03 M鹽酸氟化氫銨提取AP，按Bray法測定。用1.0 M乙酸銨提取AK，火燄光度法測定(FP640; Shanghai錛 China)。用2.0 M KCl萃取NH4+-N和NO3–N並用連續流動分析儀測量 (Santt錛 Skalar錛 Holland)。用0.5 M K2SO4萃取DOC和溶解性總N (DTN)，分別用總有機碳分析儀(Multi N/C 3000; Analytik錛 Jena錛 Germany)和凱氏定氮法測定。DON的計算如下:DTN – NH4+-N。用重量法測定了土壤含水量。土壤DNA提取與nifH基因豐度定量Soil DNA extraction and quantification of nifH gene abundance使用Fast®DNA SPIN Kit (MP Biomedicals錛 CA錛 USA)從0.5g土壤(鮮重)中提取土壤DNA，隨後使用PowerClean®DNA Clean-up Kit (MoBio錛 CA錛USA)按照制造商說明進行純化。每個土壤樣本包含三個連續的DNA提取，三次重復的DNA被合並為一個DNA樣本。用NanoDrop ND-1000分光光度計(NanoDrop Technologies錛 Wilmington錛 USA)測定提取的DNA的濃度和質量。採用實時定量PCR (real-time quantitative PCR錛 qPCR)方法，

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在LightCycler 480 real-time PCR (Roche Diagnostics錛 Mannheim錛 Germany)上用SYBR®PremixEx Taq™ (TaKaRa Bio錛 Dalian錛 China)測定nifH基因拷貝數。採用nifH基因特異性引物PolF/PolR進行qPCR擴增。qPCR程序和反應組成正如Sun等人描述的那樣。用熔融曲線分析擴增產物的特異性。為獲得標準曲線，將nifH基因片段克隆到pMD19-T載體(TaKaRa Bio)中，隨後轉入大腸桿菌DH5a感受態細胞。選擇和驗證包含正確片段長度的質粒。以質粒純化試劑盒(TaKaRa Bio)提取的質粒DNA為模板，生成標準曲線。每個DNA樣本一式三份。根據Mirza等(2014)的研究計算拷貝數和PCR擴增效率。效率為89.1%，R2值為0.99。nifH基因測序及生物信息學分析nifH gene sequencing and bioinformatics analysis：採用巢式PCR方法擴增nifH基因片段進行焦磷酸測序。引物組PolF / PolR和RoeschF / RoeschR分別用于第一次和第二次PCR擴增。PCR程序和反應組成正如Pereira e Silva等人(2013)描述。為了區分樣品，在第二次PCR擴增時，正向引物中加入了一個樣品特異性標記(7-bp條碼)。對每個樣品進行三次重復的PCR擴增，並合並為PCR產物。然後，使用瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒(TaKaRa Bio)對純化的擴增子進行定量，並按等摩爾比組合。擴增子文庫的測序是在具有300 bp配對雙端讀數長的Illumina MiSeq平台上進行的。測序數據已存入 NCBI Sequence Read Archive (SRA) 數據庫，登錄號為SRP092284。首先將來自原始數據的成對讀長與FLASH版本1.2.7合並，其中正向和反向讀長的重疊堿基長度≧10 bp，並且不允許堿基錯配。測序讀長用Mothur版本1.31.1處理。質量得分20、含有不明確核□酸或與引物和條形碼不匹配的低質量序列被刪除。根據條形碼對樣品序列進行分類後，去除條形碼和引物序列。利用the FunGene Pipeline of the Ribosomal Database Project server(http://fungene.cme.msu.edu/FunGenePipeline/)，將剩餘的序列進一步轉化為氨基酸序列。翻譯蛋白與nifH蛋白序列不匹配或含有終止密碼子的序列被丟棄。將剩餘的序列與nifH基因數據庫進行比對，剔除比對的失敗序列和嵌合序列。在Huang et al.(2016)和Pereira e Silva et al.(2013)的研究基礎上，將剩餘的高質量序列以90%的一致性分組為操作分類單元(operational taxonomic units錛 OTUs)。利用GenBank中(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)基于BLAST算法的搜索對OTUs中的代表性序列進行分類。數據分析Data analysis使用Windows的SPSS 18.0版執行統計分析(SPSS Inc.錛 Chicago錛 IL錛 USA)。使用單因素方差分析（ANOVA）確定了肥料處理之間玉米生物量，OTU數量和相對豐度的差異，並使用Duncan’s檢驗進行了多重比較(p0.05)。採用雙因素方差分析來評價施肥處理和根系效應(土體與根際)的互作效應對土壤性狀參數和總基因豐度的影響。當處理間交互因素達到顯著性差異(p 0.05)時，採用單因素方差分析或學生t檢驗分析差異程度。Pearson相關系數用于檢驗土壤性狀、nifH總基因拷貝數、OTU數與相對豐度之間的關系。為了計算群落相似性，我們通過使用R軟件(Version 3.1.2)的vegan包進行了基于otu的算術平均數的未加權對分組法的層次聚類分析，基于Bray-Curtis距離矩陣的非度量多維尺度(NMDS)，

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以及相似性分析(ANOSIM)。採用Mantel檢驗確定群落組成與各土壤變量之間的相關性。只有Mantel檢驗有顯著影響的變量(p0.05)被進一步使用R軟件進行冗餘分析。編譯：馬騰飛 南京農業大學責編：文濤 南京農業大學審核：劉永鑫 中科院遺傳發育所ReferenceChao Wang錛 Manman Zheng錛 Wenfeng Song 錛Shilin Wen錛Boren Wang錛Chunquan Zhu錛Renfang Shen. Impact of 25 years of inorganic fertilization on diazotrophic abundance and community structure in an acidic soil in southern China.Soil Biology and Biochemistry 113 (2017) 240e249 http://dx.doi.org/10.1016/j.soilbio.2017.06.019猜你喜歡10000+: 菌群分析寶寶與貓狗 提DNA發Nature 實驗分析誰對結果影響大Cell微生物專刊 腸道指揮大腦系列教程：微生物組入門 Biostar 微生物組宏基因組 專業技能：生信寶典 學術圖表 高分文章 不可或缺的人 一文讀懂：宏基因組 寄生蟲益處 進化樹必備技能：提問 搜索Endnote文獻閱讀 熱心腸 SemanticScholar Geenmedical擴增子分析：圖表解讀 分析流程 統計繪圖 16S功能預測 PICRUStFAPROTAXBugbase Tax4Fun在線工具：16S預測培養基 生信繪圖科研經驗：雲筆記雲協作 公眾號編程模板: ShellR Perl 生物科普: 腸道細菌 人體上的生命 生命大躍進細胞暗戰 人體奧秘寫在後面為鼓勵讀者交流、快速解決科研困難，我們建立了“宏基因組”專業討論群，目前己有國內外5000+ 一線科研人員加入。參與討論，獲得專業解答，歡迎分享此文至朋友圈，並掃碼加主編好友帶你入群，務必備注“姓名-單位-研究方向-職稱/年級”。技術問題尋求幫助，首先閱讀《如何優雅的提問》學習解決問題思路，仍未解決群內討論，問題不私聊，幫助同行。學習擴增子、宏基因組科研思路和分析實戰，關注“宏基因組”點擊閱讀原文，跳轉最新文章目錄閱讀https://mp.weixin.qq.com/s/5jQspEvH5_4Xmart22gjMA​問題是 應地址：http://blog.sciencenet.cn/blog-2649160-1218478.html 這個貼。王主編，您好！近來，看到國內新聞媒體和專業學術刊物仍將本病稱之為“新型冠狀病毒肺炎”，根據是2020-2-21國家衛生健康委《關于修訂新型冠狀病毒肺炎英文命名事宜的通知》。該決定《將“新型冠狀病毒肺炎”英文名稱修訂為“COVID-19”，與世界衛生組織命名保持一致，中文名稱保持不變” 》；如此提法倍感困惑。實難看出“新型冠狀病毒肺炎”與“COVID-19”一致之處。關于本病的中文“新型冠狀病毒肺炎”的命名值得商榷。為何冠以“新”字？新和舊是相對的，疾病的名稱應是特指，難以用新舊界定。盡管該病毒在英文中被稱為：novel coronavirus，其簡稱為：2019-nCoV，其中不乏有新的表述，但就醫學專業命名而言，很少以”新”字冠在疾病名稱之前；另：本病的“肺炎”提法是否準確也值得探討。近來許多學術文章均已表明本病並非僅限于肺炎，其他器官和/或系統是同時受累還是並發症也值得進一步探討。誠然，本病的“新型冠狀病毒肺炎”（ “Novel Coronavirus Pneumonia，NCP” ）提法先于“COVID-19”，但在WHO提出“COVID-19”後，若將本病英文直譯為中文可能在“保持一致”方面更有說服力。就直譯而言，coronavirus具體含義是：CO和VI都來自冠狀病毒的英文：coronavirus，而D，則代表疾病（disease）。據此，將“COVID-19”直譯為“冠狀病毒疾病19”或“冠狀病毒病19”是否更為恰當願與君磋商。北京協和醫院 餘衛 (教授)，